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金牛3娱乐中国科学家深度解析多巴胺并为神经疾病药物研发提供新思路
作者:管理员    发布于:2021-03-02 13:00    文字:【】【】【

  Cell Press细胞出版社微信公众号对这两篇论文的作者团队进行了采访并对论文进行了解读,旨在与广大科研人员深入分享该研究成果以及一些未来的展望,点击“阅读原文”阅读英文原文。

  D1和D2类多巴胺受体(D1R和D2R)分别通过Gs和Gi蛋白发出信号,分别代表了中枢神经系统中主要的刺激性和抑制性多巴胺受体。D1R和D2R也是帕金森病、精神分裂症和其他许多神经精神疾病的主要治疗靶点,深入了解它们的信号传导过程对于理解多巴胺能药物的治疗性作用和副作用至关重要。在此,我们报告了4种冷冻电镜(cryo-EM)结构,分别揭示了D1R-Gs和D2R-Gi信号复合物与选择性/非选择性多巴胺激动剂的相互作用,包括目前使用的两种抗帕金森病药物——阿扑吗啡和溴隐亭。这些结构以及诱变研究揭示了多巴胺激动剂的保守结合模式、配体选择性背后独特的口袋拓扑结构、受体激活时的构象变化,以及G蛋白偶联选择性的潜在结构决定因素。这些结果既提供了对多巴胺信号传导的分子理解,也为针对多巴胺能系统的药物设计提供了多种结构模板。

  Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者之一徐华强研究员代表研究团队进行了专访,请他为大家进一步详细解读。

  CellPress:为什么相比于选择性多巴胺激动剂,例如溴隐亭等非选择性多巴胺激动剂在治疗复杂中枢神经系统疾病方面更有效?

  徐华强研究员:中枢神经系统类疾病,比如说帕金森氏病、精神分裂症、抑郁症等,其发病机制一直处于不明确的状态,目前普遍认为其病因是多基因因素影响的,且受到外界环境以及表观遗传学调控的作用。如果靶向某一个特定的靶点,其引起的治疗效果可能并不显著,就靶向多巴胺系统的药物而言,维系多巴胺能系统稳态达到治疗效果需要多种受体的协调作用。此外,目前临床应用广泛的治疗CNS疾病的药物,比如氯氮平、阿立哌唑等,都不是特异性靶向单一GPCR靶点,呈现出复杂且不明确的药理作用机制,而这些药物的广谱作用活性又促使了药物毒副作用的发生。因此,后续在探索治疗CNS疾病的药物作用哪种靶标起到治疗效果上具有重要意义,一定程度上可以促使选择性靶向药物的开发用于更有效治疗CNS疾病。

  CellPress:在解析D1R和D2R的冷冻电镜结构时遇到了哪些难题?是如何解决的?

  徐华强研究员:为了更好地反映D1R和D2R结合激动剂的实际状态,本次研究中,我们使用野生型且全长序列的D1R和D2R开展相关研究。研究过程中,我们主要遇到两大难题,第一是获得表达量好、稳定且均一的复合物样品。在电镜结构解析中,样品的质量直接决定了结构分辨率的高低,而不同的蛋白质在生化水平会有千差万别的表现,我们需要根据每一个样品的特性优化出适合于它本身的一套纯化步骤。选用不同的小分子配体也可能影响蛋白质的稳定性。对于D1R,我们筛选了包括融合标签蛋白、去垢剂、纯化方法等在内的多种条件,通过下游G蛋白进一步稳定激活态下的受体结构,最终获得了表达量高且生化性质稳定的受体与下游G蛋白复合物的样品用于系列冷冻电镜结构解析。在D2R的结构解析过程中,我们分别尝试了多种小分子配体作为激动剂组装复合物,但结果表明很多配体会影响复合物的构象稳定性,使我们不能获得一个高分辨率的结构。经过配体和纯化条件的筛选,我们最终确定使用溴隐亭作为D2R的激动剂,并确定了特定的纯化步骤,最终获得性质稳定且均一性好的复合物样品。第二个难题是获得高质量的冷冻样品。获得稳定均一的蛋白质样品以后,如何将样品制备成适合结构解析的冷冻样品也是一个极关键的步骤。我们在制备D1R和D2R冷冻样品的过程中,都遇到过样品不易进孔、颗粒分布不均、冰层厚度不合适等问题。于是,我们从改变蛋白质溶液性质和样品制备条件入手,进行了大量筛选。比如,对于D1R,我们筛选出使用digitonin作为最终缓冲液的去垢剂,而对于D2R,使用LMNG和GDN作为最终缓冲液的去垢剂,更能帮助获得表现较好的冷冻样品。

  CellPress:野生型D2R与热稳定型D2R的结构有何差异?为什么会存在这些差异?

  徐华强研究员:我们解析的野生型D2R结构和先前发表的热稳定型的D2R结构主要在四个方面存在差异:第一、结构分辨率存在差距。我们报道的野生型D2R结构整体分辨率为2.8 Å,而先前报道的热稳定性型D2R分辨率为3.7 Å。第二、受体构象存在区别。两个结构对比,第一个跨膜螺旋(TM1)的胞外端存在明显地4.6 Å的偏移,第六个跨膜螺旋(TM6)的胞内端存在2.4 Å的偏移。第三、配体构象存在区别。两个结构都使用了相同的配体溴隐亭,但溴隐亭在两个结构中的构象略有不同。与受体正构结合口袋相互作用的吲哚环存在约1 Å的偏移,而与受体延伸结合口袋结合的三元杂环存在约1.6 Å的偏移。第四、G蛋白构象不同。野生型的D2R结合的Gαi1亚基与热稳定型D2R结合的Gαi1亚基沿着其α5螺旋的C端旋转了一定角度,引起Gαi1亚基的N端5.5 Å的偏移和Ras-like结构域3~5 Å的偏移。引起这些差异的原因可能有很多,首先,一级序列上的差异会引起三级结构的差异,热稳定型的D2R引入的突变可能会改变受体的构象;其次,电镜密度图分辨率的差异会改变模型的准确度,更高的分辨率往往能够反映更真实的结构模型;最后,样品制备条件的不同也可能导致结构的不同。在生理条件下受体的构象总是动态变化的,不同的样品制备条件可能会捕捉到不同的受体构象。我们解析的野生型D2R是在去垢剂缓冲液条件下制备的样品,而先前报道的热稳定型D2R是借助磷脂将受体组装到纳米盘(Nanodiscs)中制备的样品,这也可能是造成结构差异的原因。

  CellPress:D1R-SKF81297复合结构与b2AR-EP复合结构具有相似的受体-配体相互作用模式,但也存在一定的区别,为什么会产生这样的差异?

  徐华强研究员:胺类GPCR在配体结合口袋的相互作用模式上存在一定的保守性,这也是目前靶向胺类GPCR正性结合口袋的抗神经精神类疾病表现较多副作用的一个重要原因。然而,不同胺类GPCR在结合配体上也存在差别,这种差别是由受体本身的氨基酸组成、拓扑结构特征以及所处的外周环境引起的。在我们的研究中,通过结构比对以及功能分析,我们发现D1R和β2AR在结合儿茶酚胺类配体上相互作用的区别体现在其TM7与配体互作的差异上,尤其是TM7中一些不保守的氨基酸残基,在决定两者对单胺类神经递质的选择性上扮演重要角色。我们比较了D1R-SKF81297和β2AR-adrenaline的结构,从结构比较可以看到,D1R和β2AR表现出较高的结构相似性,配体结合口袋上氨基酸组成也类似,使得两者在结合配体激动剂上表现出一定的相似性,比如两者的邻苯二酚中的羟基均和S5.42,N6.55形成氢键相互作用。然而,D1R和β2AR在与配体的氨基相互作用区域不同,其中,与配体氨基形成较强氢键相互作用的TM7上的不保守氨基酸存在差别,并且两者对各自的内源性单胺类神经递质配体(D1R对应内源性配体为dopamine,β2AR的内源性配体之一为adrenaline)均表现更高的选择性。为了探索这些不保守氨基酸作用的内在机制,我们对D1R的TM7中与β2AR不保守的疏水氨基酸残基V317和W321进行了突变实验,发现V317突变成β2AR中对应的亲水性氨基酸N以后,可以显著提高D1R对β2AR的内源性配体adrenaline的亲和力,而W321的突变体影响较小。这些结果表明D1R中的V317在决定其对dopamine的亲和力优于其他单胺类神经递质配体上具有重要作用。此外,我们也发现D1R和β2AR在胞外结构域部分,特别是胞外loop区存在构象的差别,这些差别都可能导致两者在受体-配体相互作用模式的不同。

  徐华强研究员:SKF81297和SKF83959具有高度相似的化学结构,其区别在于SKF83959相比于SKF81297多了两个甲基,分别位于azepine环的氨基部分以及侧链苯环部分。前期研究发现,SKF83959表现出G蛋白偏好活性,而不是SKF81297,这一现象长期未得到解释。在本次研究中,我们分别解析了D1R结合SKF81297以及SKF83959的高分辨率结构,通过结构比对发现,SKF81297和SKF83959在结合D1R正性结合口袋的模式上存在差异,这种差异可能使得D1R形成特定的整体构象,更有利于其响应G蛋白信号通路。为了发现和SKF83959的G蛋白偏好性活性对应的D1R受体上的结构决定因素,我们通过进一步的突变功能实验发现,TM5上的F288,F289或者TM7上的V317突变为较小的疏水氨基酸显著性提高了SKF83959激活β-arrestin的活性,这一现象表明F288,F289以及V317与SKF83959的相互作用对于其G蛋白偏好活性至关重要。有趣的是,V317和F288这两个氨基酸都与SKF83959中azepine环的氨基部分的甲基形成疏水相互作用,这些结果表明,SKF83959上氨基部分的甲基侧链与D1R内包括F288,F289以及V317等在内的氨基酸形成的相互作用网络使得D1R维系在某一特定构象更为偏向性激活G蛋白信号。这些机制还有待后续研究中更多的新的化合物实例进行验证。

  徐华强研究员:GPCR的激活通常表现出激动剂激活条件下受体的TM5,TM6以及TM7的构象变化,这些结构的改变引起GPCR近胞内区形成一个凹腔并与下游G蛋白发生偶联,偶联发生的相互作用界面可以是多个区域,包含G蛋白和GPCR近胞内区的跨膜螺旋相互作用以及与胞内loop区域相互作用等。

  通过我们的研究发现,D1R和D2R对于下游Gs/Gi蛋白的选择性结合是多方面因素共同决定的,其中包括D1R和D2R在TM5和TM6的构象差异以及在ICL2上的结构区别。相比于D2R而言,D1R的TM5比D2R的TM5往胞内区多延伸了2.5个α螺旋并与Gs的Ras结构域发生相互作用,这种相互作用在D2R的TM5中是不存在的,这可能是D2R不偶联Gs的潜在因素之一。D1R和D2R在TM6的较大构象差异是其G蛋白选择性的另一重要原因。D1R的TM6与D2R的TM6相比朝向外部位移了8.4 Å,使得D1R形成一个较D2R更为庞大的G蛋白偶联凹腔,足以容纳Gs蛋白C末端α5尾部复杂的氨基酸侧链,而D2R激活后形成的近胞内区凹腔较小,将无法容纳Gs蛋白C末端的氨基酸侧链并与之发生空间位阻,从而只能与具有较为简单的C末端侧链的Gi蛋白偶联。

  徐华强,中科院上海药物研究所实验室主任,毕业于清华大学,在1985与1988年分别获得学士与硕士学位,随后于1994年获得美国德州西南医学中心博士学位,而后两年在美国麻省理工学院从事博士后研究。1996年到2002年,先后在葛兰素威康研究所和美国葛兰素史克任研究员。2002年任美国Van Andel研究所结构科学实验室主任,2007年提升为杰出教授和药物研发中心主任。2010年7月回到中国科学院上海药物研究所创建药物靶结构与功能中心,任中心主任。2012年8月筹建中国科学院受体结构与功能重点实验室,2013年4月批复成立,任实验室主任。2019年全职加入中科院上海药物研究所。

  徐华强的研究领域集中在核激素受体、肝脏生长因子(HGF)及其受体Met酪氨酸激酶、GPCR和植物激素等的结构和药物研发。目前已在Cell、Nature、Science等杂志发表SCI论文210余篇,包括CNS论文26篇,引用次数超过23000次,并获得专利十余项。

  研究成果发表在Cell Press旗下Cell期刊上,点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文。

  多巴胺受体包括D1和D2类受体,是各种神经系统疾病以及心血管和肾脏疾病的重要治疗靶点。在此,我们展示了5种配体与多巴胺D1受体(DRD1)-Gs异三聚体复合体结合的冷冻电镜结构,其中包括三种儿茶酚类激动剂、一种非儿茶酚类激动剂,以及一种内源性多巴胺的正向别构调节剂。这些结构表明极性相互作用网络对于儿茶酚胺类激动剂的识别是必不可少的,而延伸结合口袋中的特定模体则负责区分D1和D2类受体。此外,通过将内源性多巴胺相互作用稳定在正构位点,在独特的内表面口袋处的别构结合提高了DRD1的活性。DRD1-Gs结合界面揭示了G蛋白偶联决定因素的关键特征。总而言之,我们的研究解析了多巴胺受体DRD1-Gs信号复合物的结构特征,即DRD1的配体识别、别构调节和G蛋白偶联机制。

  Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者之一邵振华研究员代表研究团队进行了专访,请他为大家进一步详细解读。

  CellPress:本研究如何发现了多巴胺受体识别儿茶酚胺类激动剂的关键模体?

  邵振华研究员:多巴胺受体的儿茶酚类激动剂都包含典型的儿茶酚胺基团,在我们的研究中,解析了包含多巴胺在内的4种儿茶酚类激动剂与多巴胺受体DRD1-Gs复合物电镜结构。有趣的是,我们发现这类激动剂与DRD1表现出类似的结合模式,儿茶酚羟基均与TM5上的S1985.42和S2025.46形成氢键作用,而胺基团则与TM3中的D1033.32形成盐桥。此外,我们通过序列比对发现这3个残基在所有的多巴胺受体中都非常保守。在β2AR受体中,等位氨基酸残基同样参与到受体的激活,因此,我们提出D3.32-S5.42-S5.46 motif可能是所有多巴胺受体识别含儿茶酚胺类激动剂的关键模体。

  邵振华研究员:通过D1类受体 (DRD1 和DRD5,Gs coupling) 和D2类受体(DRD2,DRD3和DRD4,Gi coupling)的蛋白质序列比较、DRD1与Gs蛋白的互作与DRD2-Gi互作界面的三维结构比较,发现DRD1中TM5上保守模体A5.65xxQ5.68-I5.69及第二个胞内环的FICL2与DRD2差异较大,我们猜测这些残基决定了D1类受体和D2类受体对不同G蛋白亚基的选择性,随后,我们结合突变和生物化学实验证实了这几个残基是DRD1与Gs蛋白偶联的关键决定因素。

  CellPress:D1类受体的极性网络模体与D2类受体的有何不同?分别导致了怎样的结果?

  邵振华研究员:尽管D1类受体和D2类受体均含有保守的D3.32-S5.42-S5.46模体,导致它们能够识别相同内源性激动剂多巴胺,但是我们发现D1类受体上TM3和TM5形成的极性网络模体S3.36-N6.55与D2类受体的C3.36-H6.55模体完全不同,该模体的不同导致了两类受体配体识别和信号通路的差异,这也是未来亚型选择性配体药物开发的关键点。

  CellPress:在本研究展示的5种冷冻电镜结构中,正向结合口袋(OBP)极性网络分别有什么不同?

  邵振华研究员:除了保守的D3.32-S5.42-S5.46基序外,在这5种冷冻电镜结构中,OBP的极性网络也有细微的差异。例如,S1985.42是唯一与Fenoldopam或SKF83959的邻苯二酚羟基形成极性相互作用的残基,而S1995.43不参与 A77636的结合。

  CellPress:为什么非儿茶酚类激动剂PW0464对DRD1具有高亲和力,且能高选择性地结合DRD1?

  邵振华研究员:受体中4个跨膜螺旋以及第二个胞外环(ECL2)组成了DRD1的正位结合口袋,并发现D3.32-S5.42-S5.46是所有多巴胺受体识别含儿茶酚胺类激动剂的关键。而PW0464除了与D3.32-S5.42-S5.46基序形成极性作用外,同时将其吡啶头与苯氧基连接起来,与I1043.33、L190ECL2、F2886.51和F3137.35形成大量疏水相互作用。在TM2和ECL2区域,PW0464的嘧啶二酮基团与ECL2的D187-S189主链以及W993.28和V3177.39的侧链有广泛的接触,并与K812.61形成氢键,而有些关键残基在D2类受体中是不同的。因此,正是这些广泛的相互作用和特异性,使其能对DRD1有高度选择性。

  CellPress:这些研究发现将如何有益于神经系统疾病的治疗药物开发?

  邵振华研究员:我们的研究详细且系统阐明了DRD1与儿茶酚类激动剂、非儿茶酚类激动剂和别构调节剂的识别机制,显示出针对DRD1的激动剂药物的高选择性和高特异性是未来药物开发的热点和趋势。DRD1中延伸的正位口袋为配体的高亲和力、高选择性提供了可能性;非儿茶酚激动剂配体可穿过血脑屏障,该结构的解析为神经疾病的治疗药物开发奠定了重要基础;最重要的是,别构调节剂药物作为GPCR药物开发领域的热点,我们通过解析DRD1别构剂调节机制,揭示了别构调节剂能更好区分D1类受体(DRD1和DRD5),为针对D1类家族受体开发神经系统疾病的治疗药物提供了理论基础。

  邵振华,四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室,研究员。2014年在中国科学技术大学获得博士学位;2014年-2018年在美国UT Southwestern Medical Center从事博士后研究;2018年5月至今在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室开展独立工作,承担国家自然基金及科技部重点研发项目等。主要研究方向是探索药物靶标G蛋白偶联受体与配体识别机制、阐释别构调节新机理,发展GPCR药物开发新技术。曾解析了素受体CB1的高分辨率晶体结构,相继发现了其别构调节位点;揭示了多巴胺受体DRD1识别多样性配体的详细机制等,相关研究工作以第一作者/通讯作者在Nature、Cell、Nature Chemical Biology及Nature Communications等期刊发表。金牛3娱乐金牛3娱乐

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